肺癌ALK基因检测阴性：可能方法错了
晚期肿瘤治疗最主要的是用药，而如何更好地用药则需明确基因变异，目前我们对基因变异的诊断还没有做到绝对准确。癌度今天通过目前ALK基因诊断几个技术来分析一下，现有主流诊断技术的灵敏度，通过这篇文章您可以了解到，即便是一纸报告说ALK是阴性的，但它可能并不是100%的准确。
非小细胞肺腺癌中ALK基因突变的频率在2%-7%，对于ALK诊断的金标准是荧光原位免疫杂交（FISH），另外临床也常用免疫组化（IHC）来检测ALK的融合，还有一些医院会使用逆转录PCR来检测ALK的融合突变，最近比较热的还有二代基因测序（NGS）来检测ALK突变。
今天这篇文章通过数据来比较这四种检测技术，癌度与大家一起来看看各自的水平如何。
首先来说两个概念，检测灵敏度和特异度。灵敏度是指将真正存在ALK融合突变的样本检测出来的能力，也就是判断为真阳性的比例。而特异度是指将ALK基因没有发生突变的样本检测出来的能力，即判断为真阴性的比例。一个完美的技术应该是灵敏度和特异度都为100%。
NGS，也就是二代测序技术：95个样本，检测出77个，灵敏度为81.1%。
RT-PCR：96个样本中检测出77个，检测灵敏度为80.2%。
有60个样本同时使用四种方法检测，其中55个样本的检测结果是一致的，包含43个ALK阳性的样本，12个ALK阴性的样本。
如果使用免疫组化IHC和原位免疫荧光杂交FISH两种技术检测的一致性结果作为标准，则RT-PCR和二代测序检测的灵敏度是70%和85%，检测的特异性是87.1%和79%。
如果将免疫组化IHC与RT-PCR或二代测序结合起来，其灵敏度没有提示，但是检测的特异性提升至了88.7%和83.9%。
读到这里，您可能会失望了，怎么没有看到100%这个数字？甚至是两种检测方法结合起来也不是100%，要知道这还是只有95个样本，那么一年几十万肺癌患者，多少会被漏检了，或者多少是被错误地判断为ALK阳性，花费很多但吃靶向药物无效呢？
如上图，将不同的检测技术进行比较，几乎没有可以在灵敏度和特异度都达到100%的情况（免疫组化的2+和3+都归结为阳性）。为什么这些检测技术不能达到100%，都会有假阴性或者假阳性的结果呢？这篇论文中研究者做出了一定的分析。
如上图所示，RT-PCR和免疫组化、FISH检测的结果就是上面这样，但是要给一个样本判断是阳性还是阴性，是需要人为去计数和评估的。
免疫组化IHC：可能是失败的染色技术，或者穿刺的样本里癌细胞比例不够，另外使用的抗体和检测技术也会影响检测结果。
原位免疫荧光杂交FISH是ALK检测的金标准，但是从这个研究来看，它也不能给出100%的把握，这主要受限于病理技师的准确评估。因为这种检测需要在显微镜下计数荧光分离信号，比如计数多少个算是阳性等，也难免有出错。
逆转录PCR也就是RT-PCR的局限性只能检测已知的易位，如果一个易位不常见就漏检了。还有一个原因是有些样本不一样能提取出来RNA，不像是DNA，RNA很容易降解，而RNA质量影响了检测结果。
二代基因测序NGS。按说这个方法应该是绝对准确的吧，很遗憾，它也不能保证灵敏度和特异性是100%，部分原因可能是与建库，样本取材有一定关系。但二代测序检测出来的应该就是存在的（除去一些做假报告的公司以外），但是如果二代测序没有测出来，就说没有ALK突变，也不能那么绝对，尤其是使用血液样本检测的情况下，由于现在二代测序技术多数是捕获建库测序，还是有一定概率出现假阴性。
如上图所示，四种检测技术在这几十个样本中，存在一定的不一致情况，有的检测技术阳性结果，但是其他的技术就是阴性结果。
这也提醒我们不能将检测报告的结果完全地绝对化，如果按照检测报告用药不是很好，则需要考虑使用另外的技术再次做验证，即便是组织样本检测的结果，也不是100%地绝对化。在这里，检测的基因数目，价格甚至还不是完全重要的，关键是技术和数据分析要过关。
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参考文献：
Igor Letovanec, et al., Evaluation of NGS and RT-PCR methods for ALK rearrangement in European NSCLC patients: Results from the ETOP Lungscape Project，J Thorac Oncol. 2018 Mar;13(3):413-425.
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